Pertumbuhan dan Uji Kualitatif Kandungan Metabolit Sekunder Kalus Gatang (Spilanthes acmella Murr.) dengan Penambahan PEG untuk Menginduksi Cekaman Kekeringan

Abstract 

The study about the growth and qualitative test of secondary metabolite content of the callus culture of Spilanthes acmella Murr. with addition of PEG to induce drought stress had been done used completely randomized design with six treatments and six replications. The treatments were the addition of PEG in various consentration : 1%, 2%, 3%, 4%, 5% and control (without addition of PEG). The result showed that the addition of PEG  to medium could decrease fresh weight of callus. The fresh weight of callus was decrease significantly by addition 5% PEG. On the qualitative test of secondary metabolite, alkaloid  content was increase by addition of  2% - 5% PEG (++), terpenoid content was increase by addition 3% - 4% PEG (++) and fenolik was found on 4% PEG (+). 
Keywords: callus culture, secondary metabolite, PEG, drought stress, Spilanthes acmella   

Pendahuluan

  
Sekitar 60-75% penduduk bumi menggantungkan kesehatannya pada tumbuhan (Harvey, 2000). Salah satu tanaman berkhasiat obat ini adalah gatang (Spilanthes acmella Murr.). Tanaman Gatang (Spilanthes acmella Murr.) yang termasuk ke dalam famili Asteraceae telah digunakan sebagai obat tradisional untuk sakit gigi, sakit kepala, asma, rematik, demam, radang tenggorokan dan wasir (Wongsawaktul dan prachayasittikul, 2008). Ekstrak dari tanaman Gatang juga menunjukkan aktivitas anti mikroba, antioksidan, dan  efek sitotoksik (Prachayasittikul et al., 2008). Spilanthes acmella Murr. mengandung berbagai metabolit sekunder seperti alkaloid (spilanthol) (Gokhale dan Bhide, 1945, cit. Wongsawatkul dan Prachayasittikul, 2008), triterpenoid seperti
asam 3-acetylaleuritolic, b-sitostenone, stigmasterol dan stigmasteryl-3-OBD- glucopyranosides dan fenolik (asam vanilat, asam trans-ferulat dan asam trans- isoferulic), kumarin (scopoletin) (Prachayasittikul et al., 2009).  Salah satu upaya untuk menghasilkan metabolit sekunder dengan jumlah yang banyak adalah dengan teknologi kultur jaringan seperti kultur kalus (Kristina et al., 2007). Namun, Mantell dan smith (1983) menyatakan bahwa pada umumnya kandungan metabolit sekunder dalam kultur relatif rendah. Hal ini disebabkan oleh pembentukan metabolit sekunder dipengaruhi oleh faktor internal dan faktor eksternal. Faktor eksternal seperti pemberian elisitor untuk menim- bulkan kondisi tercekam dapat digunakan untuk meningkatkan metabolit sekunder (Di Cosmo dan Masawa, 1995). Elisitor merupakan stimulus fisika, kimia maupun
Jurnal Biologi Universitas Andalas (J. Bio. UA.) 1(1) – September 2012 : 1-8
biologi yang dapat menginduksi respon pertahanan tumbuhan.  Media padat yang ditambahkan elisitor PEG telah digunakan untuk menciptakan kondisi cekaman kekeringan dengan menurunkan potensial air pada medium pada berbagai percobaan kultur jaringan. Potensial air yang rendah di medium menurunkan pembelahan sel dan meningkatkan kandungan metabolit sekunder (Ehsanpour dan Razavizadeh, 2005).  Konsentrasi pemakaian PEG sebagai pengatur cekaman kekeringan secara in vitro bervariasi dengan kisaran 0,2- 20%. Dragiiska et al. (1996) memakai 5-10% PEG pada tanaman alfalfa (Medicago sativa). Penelitian Astuti (cit. Yulinda, 2010) melaporkan bahwa kandungan alkaloid dari tanaman Catharantus roseus mengalami peningkatan dengan penambahan 1, 3, 5 dan 7 % PEG. Sedangkan Yulinda (2010) melaporkan bahwa kandungan metabolit sekunder triterpenoid pada kultur in vitro tanaman Centella asiatica meningkat dengan penambahan 1 dan 2 % PEG.  Penelitian ini dilakukan dalam mempelajari penggunaan elisitor berupa PEG dalam peningkatan kandungan metabolit sekunder pada tanaman gatang (Spilanthes acmella Murr.).  

ABSTRAK KEMANGI

ABSTRACT

Kemangi (Ocimum basilicum L.) be multifunction plant was develop in Indonesia. This research to know information about standardization parameters from kemangi leaf (Ocimum basilicum L.) extract including water content, ash content, water-soluble ash content, acid- insoluble ash content, specific gravity, water-soluble extractives, alcohol-soluble extractives, was carried out. Value of standardization parameters from kemangi leaf extract Bandung are 9,5%, 4,68%, 82,86%, 1,47%, 0,82, 4,33%, 64,33%, kemangi leaf extract Cianjur are 9,83%, 7,78%, 93,37%, 2,08%, 0,85, 22,33%, 53,00%, and kemangi leaf extract Solo are 13,67%, 9,98%, 92,59%, 5,95%, 0,87, 41,67%, 49,67%.Phytochemical filtering to kemangi (Ocimum basilicum L) leaf could be found that metabolite compound contained in it was flavonoid, tanin, steroid, and saponin. Volatile oil content in kemangi leaf for 0,132%. GC-MS result on the third samples showed there are linalool with content was on kemangi leaf extract Bandung for about 2,62%, Cianjur 19,85% and Solo 27,80%.

Key word: Kemangi leafs, standardization paramet

Asam usnat

BAB I

PENDAHULUAN

            Tumbuhan memiliki banyak kandungan senyawa kimia yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat. Terkadang, banyak penyakit yang tidak dapat disembuhkan dengan obat kimia melainkan dapat disembuhkan dengan obat alami dari tumbuhan.

            Asam usnat adalah salah satu jenis asam yang diperoleh dari lumut kerak genus Usnea, juga dapat diperoleh dari lumut kerak lain dari genus Ramalina (Usneaceae) dan Cladonia (Cladoniaceae). Di antara flora ulat (lumut-lumutan berkulit keras) yang sangat banyak jumlahnya, hanya beberapa saja yang digunakan dalam industri jamu di Indonesia. Semuanya termasuk marga Usnea. Di Indonesia jenisjenis tanaman Usnea hanya diperoleh di daerah pegunungan pada ketinggian 1000 meter. Usnea tumbuh secara epifit pada cabang kayu. Berbagai jenis Usnea banyak digunakan sebagai obat untuk berbagai penyakit di berbagai negara termasuk Indonesia. Asam usnat ditemukan dalam beberapa produk jamu di Indonesia (1).

1.1.        Perumusan Masalah

a.    Dari identifikasi simplisia, bagaimana organoleptis dan mikroskopis dari usnea spp (Kayu Angin) ?

b.    Dari uji kemurnian, bagaimana kadar murni dari usnea spp ?

c.    Golongan senyawa apa saja yang terdapat pada usnea spp ?

1.2.        Tujuan

a.     Untuk mengetahui identifikasi simplisia usnea spp (kayu angin) secara makroskopik   dan mikroskopik.

b.    Untuk mengetahui kemurnian dari simplisia usnea spp (kayu angin)

c.    Untuk mengetahui golongan senyawa yang terdapat pada simplisia usnea spp (kayu angin)

d.    Untuk mengetahui metode yang digunakan untuk menegetahui golongan senyawa yang terdapat pada simplisia usnea spp (Kayu angin)

1.3.        Manfaat

a.    Sebagai bahan informasi tentang fragmen mikroskopis khas yang terdapat dalam usnea spp (Kayu angin)

b.    Sebagai bahan informasi tentang kemurnian dari simplisia usnea spp (Kayu angin)

c.    Sebagai bahan informasi tentang golongan senyawa yang terdapat pada simplista usnea spp (Kayu angin)

d.    Sebagai bahan informasi tentang metode apa yang digunakan untuk mengentahui golongan senyawa yang terdapat pada simplisia usnea spp (Kayu angin)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Usnea sp

A.      Tinjauan Botani

a.      Klasifikasi Tanaman

        Divisi           : Thalophyta

        Sub Divisi   : Lichenes

        Klass           : Ascholichenes

        Sub Klass   : Hymenoascolichenes

        Ordo           : Lecanorineae

        Famili          : Usneaceae

        Genus         : Usnea

        Spesies       : Usnea spp

b.      Morfologi Tanaman

        Kayu angin merupaka dua organisme yang terdiri atas cendawan dan ganggang protococcus yang bersimbiosis membentuk suatu kesatuan individu. Keseluruhan tumbuhan uumnya berwarna hijau pucat kebiruan, tumbuhan tegak atau berjumbal, dan panjangnya sampai 30 cm atau lebih. Cabang-cabangnya pejal atau kosong, membentuk talus berupa benang atau ranting, bentuknya bulat memanjang, cabang bervariasi, sering kali kasar, berwarna hijau kelabu, atau hijau kekuningan. Di Indonesia terutama di jumpai di daerah pegunungan, namun dapat pula dijumpai di dataran rendah dengan kelembaban udara yang cukup tinggi. Kayu angina tumbuh sebagai epifit di dahan kayu yang tinggi sebab cahaya dan kelembaban tinggi merupakan factor yang mutlak bagi perkembangannya.

        Sebagai epifit kayu angin hidup menempel pada cabang atau kulit pepohonan di daerah pegunungan. Keberadaannya sangat bergantung pada tumbuhan inang serta lingkungan yang menjadi tempat tumbuhnya. Kayu angina merupakan obat yang sangat penting dan banyak digunakan sebagai ramuan obat tradisional.

Keterangan gambar :

1.      Thalus, bentuknya seperti serabut, kulit seperti tanduk, rapuh terdiri atas hipa-hipa berdinding tebal, bersepta dan tegak lurus pada poros bujur.

2.      Apothesium, merupakan badan buah yang berbentuk bulat, biasanya besar dengan tepi berambut.

B.          Tinjauan Kimia

1.      Kandungan kimia dari tanaman

                        Usnea spp mengandung asam usnin, babatolat, usnetin, asam barbatin. Disamping itu Usnea spp juga mengandung saponin, flavonoid dan polifenol. Dilaporkan bahwa asam usnin yang dikandung usnea spp mempunyai potensi antibakteri yang efektif terhadap bakteri gram positif.

2.      Tinjauan Kimia Khusus

                        Kandungan bahan usnin dalam usnea spp akan mengalami penurunan dalam keadaan basah, dan asam usnin juga dapat mengalami kerusakan oleh logam (misalnya besi). Pada penyimpanan selama 40 hari dengan kelembaban relative yang sesuai dan di ekstrak dengan metode Marsark, menunjukan tidak hilangnya kandungan asam usnin. Ekstraksi lichen (lumut kerak) dengan peralatan dari stainless steal menunjukan presentasi hasil yang sama dengan menggunakan peralatan dari gelas .

                        Hasil isolasi asam usnin oleh Marshaks dalam bentuk Kristal menunjukan sifat : dapat larut dalam aceton panas, alcohol, eter, larut sedikit demi sedikit dalam minyak panas dan tidak larut dalam air.

                        Rumus molekulnya C₁₈H₁₆O₇ dengan berat molekul 334,31 dan melebur pada suhu 193-194ᵒ C.

Stuktur kimia asam usnin

C.         Tinjauan Farmakologi

            Tumbuhan ini digunakan sebagai obat untuk melarutkan lemak yang berlebihan, pengobatan penyakit TB, dan untuk memperbaiki pencernaan. Batangnya dapat digunakan sebagai obat sakit perut, bisul, borok, disentri, dan sariawan, perut kembung, influenza, pening, sukar kencing, pening,

            Hasil penelitian lainnya mengatakan bahwa sifat toksisitas asam usnin menunjukan LD 50 2 mg per 25 gr berat badan tikus dalam 18 jam, subkutaneus.

BAB III

METODOLOGI

A.    Penapisan Fitokimia

            Skrining fitokimia merupakan suatu analisa kualitatif kandungan kimia tumbuhan atau bagian tumbuhan. Skring dapat dilakukan dengan metode KLT (kromatografi Lapis Tipis) karena KLT mempunyai beberapa kelebihan dibanding kromatografi kertas yaitu dapat mengahasilkan pemisahan lebih sempurna,kepekaan yang lebih tinggi,dilaksanakan hanya beberapa menit saja, dapat dipakia preaksi kolosif, dapa dipakai senyawa hidrofob. Pada penggunakan KLT menggunakan fase gerak dan fase diam dimana fase diam menggunakan silika gel. Fase diam (lapisan penyerap) yang khusus digunakanuntuk KLT yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Silika gel ini menghasilkan perbedaan dalam efek pemisahan yang tergantung pada cara pembuatannya. Selain itu fase gerak (pelarut pengembang) ialah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak ini menggunakan eluena dan etil asetat karena bersifat kepolaran dari minyak atsiri dengan perbandingan (93:7) juga menggunakan eluena IPA dan aquadest (1/3:1/4)

            Namun selain itu skrining fitokimia juga dapat dilakukan dengan Uji fitokimia terhadap kandungan senyawa kimia metabolit sekunder yang  merupakan langkah awal yang penting dalam penelitian mengenai tumbuhan obat atau dalam hal pencarian senyawa aktif baru yang berasal dari bahan alam yang dapat menjadi precursor bagi sintesis obat-obat baru atau menjadi prototype senyawa aktif tertentu. Oleh karenanya, metode uji fitokimia harus merupakan uji sederhana tetapi terandalkan. Metode uji fitokimia yang banyak digunakan adalah metode reaksi warna dan pengendapan yang dapat dilakukan di lapangan atau di laboratorium

            Skrining untuk isolasi asam usnat  dilakukan dengan menggunakan metoda reaksi kimia dikarenakan pertimbangan mengenai waktu, tingkat kesulitan, dan peralatan yang lebih sederhana. Pada dasarnya bila menggunakan teknik KLT masih bisa dilakukan hanya saja dikhawatirkan waktu yang lebih lama.

B.    Ekstraksi

            Ekstraksi dari bahan alam dapat dilakukan dengan menggunakan bahan segar atau yang telah dikeringkan. Bila bahan segar digunakan pemanasan dan pada bahan yang dikeringkan, bahan dipotong halus dan dicelupkan pada alkohol. Ekstraksi tumbuhaan menggunakan perkolar yan dapat dilakukan dengan berbagai metoda antara lain:

1.      Maserasi

           Merupakan proses ekstraksi yang sederhana dengan merendam bahan pelarut dalam waktu tertentu sampai bahan menjadi lunak sehingga senyawa yang dikandungnya ditarik oleh pelarut yang digunakan.

2.      Perkolasi

           Dengan menggunakan perkolar yang terbuat dari kaca tebal dan diujung alat terdapat kapas atau kertas saring.

3.      Digestasi.

           Proses penyaringan yang sama deengan meserasi yakni menggunakan pemanasan pada suhu 30°-40° C.

4.      Infusa

           Suatu cara yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia nabati pada suhu 90° C selama 15 menit.

5.      Decokta.

           Penyarian dengan merebus simplisia dengan air 100 bagian pada suhu 90° C selama 30 menit

6.      Sokletasi.

           Merupakan suatu cara ekstraksi dengan alat soklet. Pada cara ini pelarut organik dan tempat simplisia terpisah. Prinsipnya adalah penyarian berulang-ulang sehingga penyarian lebih sempurna dengan pelarut yang lebih sedikit.

Asam usnat termasuk kedalam golongan polifenol. Dalam proses ekstraksi untuk penarikan  senyawa polifenol dilakukan dengan teknik sokletasi. Pemilihan teknik di dasarkan pada karakteristik senyawa yang akan di murnikan. Dalam hal ini asam usnat cukup stabil dalam pemanasan, dan di tinjau dari perasalatanya cukup sederhana.

Mengenai pelarut yang di gunakan untuk penarikan senyawa polifenol ini menggunakan pelarut polar. Hal tersebut dilakukan karena kebanyakan dari senyawa fenolat adalah polar. Selain itu sifat dari pada senyawa yang akan di murnikan bersifat polar.

C.   Pemantauan ekstrak

Setelah melakukan ekstraksi maka akan di peroleh Ekstrak, ekstrak yang di peroleh kemudian di lakukan pengujian lanjutan dengan menggunakan metode KLT. Hal ini dilakukan untuk memastikan keberadaan senyawa polifenol yang terdapat dalam sampel, yang sebelumnya telah dilakuka pemisahan dengan metoda sokletasi.

Pemilihan metode KLT didasarkan pada kemudahan dalam melaksanakannya dan dalam pertimbangan waktu juga. 

Untuk perbandingan berdasarkan literature adalah sebagai berikut :

Untuk fase geraknya menggunakan fase gerak  :  Kloroform-etil asetat-asam formiat (0,5:9:0,5)  dan penampak noda: pereaksi FeCl3 10%

  

D.   Fraksinasi

Fraksinasi adalah proses pemisahan suatu kuantitas tertentu dari campuran (padat, cair, terlarut, suspensi atau isotop) dibagi dalam beberapa jumlah kecil (fraksi) komposisi perubahan menurut kelandaian. Pembagian atau pemisahan ini didasarkan pada bobot dari tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar sedang fraksi yang lebih ringan akan berada diatas. Fraksinasi bertingkat biasanya menggunakan pelarut organik seperti eter, aseton, benzena, etanol, diklorometana, atau campuran pelarut tersebut. Asam lemak, asam resin, lilin, tanin, dan zat warna adalah bahan yang penting dan dapat diekstraksi dengan pelarut organik (Adijuwana dan Nur 1989).

Fraksinasi bertingkat umumnya diawali dengan pelarut yang kurang polar dan dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar. Tingkat polaritas pelarut dapat ditentukan dari nilai konstanta dielektrik pelarut. Emapat tahapan fraksinasi bertingkat dengan menggunakan  empat macam pelarut yaitu (1) ekstraksi aseton, (2) fraksinasi n-heksan, (3) fraksinasi etil eter, dan (4) fraksinasi etil asetat (Lestari dan Pari 1990).

Macam – macam proses fraksinasi:

a)     Proses Fraksinasi Kering (Winterization)

Fraksinasi kering adalah suatu proses fraksinasi yang didasarkan pada berat molekul dan komposisi dari suatu material. Proses ini lebih murah dibandingkan dengan proses yang lain, namun hasil kemurnian fraksinasinya rendah.

b)      Proses Fraksinasi Basah (Wet Fractination)

Fraksinasi basah adalah suatu proses fraksinasi dengan menggunakan zat pembasah (Wetting Agent) atau disebut juga proses Hydrophilization atau detergent proses. Hasil fraksi dari proses ini sama dengan proses fraksinasi kering.

c)      Proses Fraksinasi dengan menggunakan Solvent (pelarut)/ Solvent Fractionation

Ini adalah suatu proses fraksinasi dengan menggunakan pelarut. Dimana pelarut yang digunakan adalah aseton. Proses fraksinasi ini lebih mahal dibandingkan dengan proses fraksinasi lainnya karena menggunakan bahan pelarut.

d)      Proses Fraksinasi dengan Pengembunan (Fractional Condentation)

Proses fraksinasi ini merupakan suatu proses fraksinasi yang didasarkan pada titik didih dari suatu zat / bahan sehingga dihasilkan suatu produk dengan kemurnian yang tinggi. Fraksinasi pengembunan ini membutuhkan biaya yang cukup tinggi namun proses produksi lebih cepat dan kemurniannya lebih tinggi.

     

      Asam usnat dapat di peroleh dari ekstrak tadi dengan cara fraksinasi dengan menggunakan pelarut, dan fraksinasi yang dilakukan adalah fraksinasi secara bertingkat. Dilakukan fraksinasi bertingkat di karenakan untuk memperoleh senyawa yang lebih murni. Dengan menggunakan pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda, bisa lebih melarutkan pengotor yang terdapat pada ekstrak yang di peroleh sebelumnya.

E.  Pemantauan Fraksi

      Fraksi yang diperoleh dilakukan pengujian dalam tahap lanjut yang dimaksudkan untuk memastikan keberadaan asam usnat yang di peroleh. Dilakukan pada masing-masing fraksi (ada 3 fraksi) dengan tujuan untuk mengetahui pada fraksi mana asam usnat di peroleh. Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan metode KLT dengan menggunakan bantuan penampang bercak.

Dengan nilai perbandingan sebagai berikut :

Nilai Rf pada kromatografi lapis tipis dengan cairan pengembang heksan (6:4) dan etil asetat (7:3) berturut-turut adalah 0.61 dan 0.69.

F.  Pemurnian dan Uji Kemurnian

Pemurnian merupakan suatu proses untuk meningkatkan kualitas suatu bahan agar mempunyai nilai jual yang lebih tinggi. Beberapa metode pemurnian yang dikenal adalah secara kimia ataupun fisika.

Teknik pemurnian :

1.    Kristalisasi dan rekristalisasi

      Kristalisasi adalah suatu teknik untuk mendapatkan bahan murni suatu senyawa. Dalam sintesis kimia banyak senyawa-senyawa kimia yang dapat dikristalkan. Untuk mengkristalkan senyawa-senyawa tersebut, biasanya dilakukan terlebih dahulu penjenuhan larutan kemudian diikuti dengan penguapan pelarut serta perlahan-lahan sampai terbentuk kristal. Rekristalisasi adalah suatu teknik pemurnian bahan kristalin. Seringkali senyawa yang diperoleh dari hasil suatu sintesis kimia memiliki kemurnian yang tidak terlalu tinggi. Untuk memurnikan senyawa tersebut perlu dilakukan rekristalisasi.

2.    Sublimasi adalah peristiwa penguapan secara langsung padatan kristalin kedalamfasa uap.

3.    Destilasi adalah pemurnian cairan berdasarkan perbedaan titik didih dengan jalan mendidihkannya, mendinginkan uap yang terbentuk dan mengumpulkan cairan yang diperoleh dari pendingin uap.

Dalam tahap pemurnian yang dilakukan adalah menguapkan senyawa dari fraksi semipolar  hingga kering. Atau proses yang dipilih merupakan kristalisasi. Kemudian Kristal yang di peroleh tadi di cuci dengan menggunakan eluen yang sesuai. Hal ini dimaksudkan untuk lebih memurnikan senyawa yang akan di tarik.

G.   Karakterisasi dan Identifikasi

a.    Uji Titik Leleh

            Kebanyakan senyawa organik yang berwujud kristal mempunyai titik leleh cukup rendah sehingga mudah ditetapkan dengan alat sederhana. Kimiawan organik secara rutin menggunakan titik leleh untuk membantu menidentifikasikan senyawa kristal dan untuk mendapat keterangan tentang kemurniannya.

b.    HPLC (High Performance Liquid Chromatography)/KCKT

            KCKT (kromatografi cair kinerja tinggi) telah terbukti menjadi cara terbaik untuk menemukan jejak kecil bahan kimia dan untuk mengukur hasil studi kimia. Zat baru masih terus ditemukan setiap tahun dan struktur mereka ditentukan.

c.    Kromatofrafi Lapis Tipis

            Teknik TLC/KLT fasa diam (terutama silika, alumina, dan selulosa) dilapiskan di permukaan sbuah plat pendukung (umumnya dibuat dari bahan kaca atau lembaran logam Al). Bila noda telah kering plat diletakkan secara vertikal dalam bejana yang sesuai dengan tepi yang di bawah dicelupkan dalam fasa bergerak yang terpilih, maka pemisahan kromatografi penaikan akan diperoleh.

            Pada akhir perkembangan, pelarut dibiarkan menguap dari plat dan noda-noda yang terpisah dilokalisir dan diidentifikasi dengan cara-cara fisika dan kimia seperti yang digunakan dalam kromatografi kertas.

            Dalam tahap ini untuk karakterisasi senyawa asam usnat dilakukan dengan menggunakan metoda KLT. Dengan hasil rf pembanding adalah : dengan harga Rf 0,5; 0,75; dan 0,7.

Untuk identifikasi dilakukan dengan menggunakan bantuan spektro UV pada panjang gelombang 254 nm 

BAB IV

ALAT DAN BAHAN

a.    Skrinning fitokima

Metode    : Reaksi Kimia

Alat          :

1.    2 tabung reaksi

2.    Gelas kimia 500 mL

3.    Kompor Listrik

Bahan :

1.    1 g sampel

2.    100 mL aquadest

3.    FeCl₃  10%

b.    Ekstraksi

Metode    : Sokletasi

Alat          :

1.    Labu soklet

2.    Labu didih

3.    Gelas ukur

4.    Kompor listrik

5.    Oven

Bahan      :

1.    50 gram sampel

2.    300 mL eter

3.    300 mL methanol 90%

4.    300 mL methanol 50 %

c.    Fraksinasi

Metode : Ekstraksi cair-cair

Alat          :

1.    Corong pisah

2.    Statip

3.    Labu ukur

4.    Erlenmeyer 250 mL

Bahan      :

1.    sampel

2.    Metanol

3.    N-heksan

4.    Etil asetat

5.    Metilen klorida

d.    Uji pemurnian

Metode    : KLT

Alat          :

1.    Kertas whatman

2.    Pipa kapiler

3.    Bejana

4.    Gelas ukur 10 mL

5.    Batang pengaduk

6.    Spektro UV /IR

Bahan      :

1.      Fraksi Sampel

2.      Etil asetat

3.      Aseton

4.      Methanol

5.       

e.    Karakteristik

Metode    : KLT

Alat          :

1.    Kertas whatman

2.    Pipa kapiler

3.    Bejana

4.    Gelas ukur 10 mL

5.    Batang pengaduk

6.    Spektro UV /IR

BAB V

RENCANA KERJA

1. Skrinnimg fitokim

Plan A

1.      Timbang sampel sebanyak 50 gram, cuci besih, tambahkan aquadest 200 mL, panaskan smpai mendidih

2.      Saring, dinginkan

3.      Ambil sedikit sampel uji sebanyak 10 mL, masukan kedalam tabung reaksi

4.      Tambahkan tetes demi tetes FeCl₃ 10 %, adanya warna hitam menunjukan sampel positif

Plan B

1.      Sampel yang telah dihaluskan sebanyak 1.233 g direndam dengan metanol kemudian disimpan di tempat yang terlindung cahaya matahari selama lima hari sambil sekali-sekali dishaker.

2.      Selanjutnya filtrat metanol dipisahkan dengan cara filtrasi. 

3.      Filtrat metanol diuapkan dengan  rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak metanol,

4.      ekstrak ini dimasukkan di  topless kecil yang telah dilapisi alumunium foil dan ditempatkan di desikator.

5.      Identifikasi senyawa golongan polifenol  Fase gerak  :  Kloroform-etil asetat-asam formiat (0,5:9:0,5) 

6.      Penampak noda: pereaksi FeCl3 10%  

7.      Jika timbul warna hitam setelah penyemprota pereaksi FeCl 10% menunjukkan adanya senyawa polifenol dalam ekstrak.

           

2. Ekstraksi

1.      Ditimbang 500 gram sampel, kemudian dicuci dan ditiriskan.

2.      Dengan menggunakan pisau atau gunting bahan yang sudah kering di potong-potong sekecil mungkin, kemudian di bungkus dengan kertas saring dan dimasukan ke dalam soklet.

3.      Serbuk kering diekstraksi secara sinambung menggunakan alat soxhlet dengan pelarut aseton selama 8 jam. Atau hingga bahan terekstrak sempurna. (terlihat dari warna bening pada pelarut yang mengenai bahan.

4.      Hasil ekstraksi di saring,selanjutnya diuapkan sehingga di peroleh ekstrak aseton (sekitar 5-6 mL)

3. Pemantauan ekstrak

1)         Ditotolkan ekstrak pekat aseton pada lempeng kromatografi dengan ukuran lempeng 10 x 20 cm dengan jarak penotolan 2 cm dan jarak rambat 11,5 cm.

2)         Dieluasi dengan larutan pengembang I  (Asam asetat : Kloroform dengan perbandingan 1 : 9) sampai mencapai jarak rambatnya.

3)         Bercak dibaca pada lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.

4)         Pada larutan pengembang I hasil kromatogram diuapi dengan NH3.

5)         Dihitung harga Rf untuk sampel.

4. Fraksinasi

Plan A

1.      Dilakukan penyarian dari ampas hasil ekstraksi sebelumnya

2.      Ampas serbuk di keringkan

3.      Disari dengan menggunakan metanol, sampai pelarut benar-penar bening (fraksi metanol)

Plan B

1.      Ukur sampel sebanyak      mL

2.      Masukan kedalam corong pisah, lalu tambahkan pelarut campuran n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan 8:2

3.      Aduk, atau di kocok sebagaimana mestinya

4.      Lakukan ekstraksi dan di peroleh fraksi I

5.      Fraksi I dimasukan kedalam corong pisah lalu di tambahkan pelarut metilen klorida dan metanol dengan pebandingan 7:3

6.      Aduk, dan kocok sebagaimana mestinya

7.      Lakukan ekstraksi sampai senyawa terpisah, maka di peroleh fraksi II

8.      Fraksi II diambil dan dimasukan lagi kedalam corong pisah, lalu tampahkan pelarut kloroform dan metanol dengan perbandingan 7:3

9.      Aduk, dan kocok sebagaimana mestinya

10.  Lakukan ekstraksi sampai senyawa terpisah, maka di peroleh hasil fraksi III

11.  Setelah dilakukan ekstraksi pada tahap akhir dan dilakukan uji pemantauan fraksi, maka hasil diuapkan sampai kering . Lalu residu dilarutkan dalam sedikit aseton dan ditambahkan pelarut n-heksan, didiamkan satu malam hingga terbentuk kristal warna putih kekuningan.

5. Pemantauan Fraksi

1.      Sebelumnya siapkan pengembang campuran pelarut antara etil asetat-metanol (8:2)

2.      Siapkan kertas silika

3.      Beri garis (untuk ciri pengembangan)

4.      Siapkan pipa kapiler,

5.      Totolkan pada kertas yang telah di beri garis, dan atur penotolannya hingga dalam proses pengembangan tidak saling tumpang tindih.

6.      Biarkan mengembang hingga batas yang di tentukan

7.      Untuk penampang bercak menggunakan asam sulfat 10% dalam metanol

8.      Hitung nilai Rf, bandingkan dengan literatur Rf dari senyawa asam usnat

6. Uji pemurnian dan kemurnian

Uji pemurnian

1.         Fraksi metanol yang diperoleh dari fraksinasi sebelumnya kemudian di kumpulkan dan diuapkan sampai kering.

2.          Lalu residu dilarutkan dalam sedikit aseton dan ditambahkan pelarut n-heksan, didiamkan satu malam hingga terbentuk kristal warna putih kekuningan.

Uji kemurnian

1.      Ditotolkan ekstrak pekat methanol pada lempeng kromatografi dengan ukuran lempeng 10 x 20 cm dengan jarak penotolan 2 cm dan jarak rambat 11,5 cm.

2.      Dieluasi dengan larutan pengembang I  ( heksan : etil asetat  (6:4) dan (7:3) sampai mencapai jarak rambatnya.

3.      Bercak dibaca pada lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.

4.      Dihitung harga Rf untuk sampel

.

7. Identifikasi dan karakterisasi

Identifikasi

1.     Ekstrak sampel di uji menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk mengetahui komposisi pelarut yang memberikan pemisahan terbaik.

2.     Sebelumnya dilakukan pengembangan eluen heksan : etil asetat (4:1)

3.     Plat KLT disemprot dengan penampak noda larutan 10% H2SO4 dalam metanol.

4.     Noda yang diperoleh dilihat dibawah sinar UV 264 nm

            Karakterisasi

1.         Untuk pengujian titik leleh, dilakukan dengan alat melting block

2.         Sedangkan untuk karakterisasi secara organoleptis dilakukan dengan pengamatan mengenai bentuk kristal.

DAFTAR PUSTAKA

Ø  Buku & Jurnal Penelitian:

Cansaran D, Kahya D, Yurdakulol E, Atakol O. Identification and quantitation of usnic acid from the lichen Usnea species of Anatolia and antimicrobial activity. Z Naturforsch C. 2006;61:773-776.

         

Tjirosoepomo, gembong. 1989. Taksonomi Tumbuhan. Yogyakarta: Gajah Mada University Press

Solichin,M.,Merati,Y.,Myrna,S.N., Analisa Kuantitatif Asam Usnat secara KLT-Densitometri, Warta Tumbuhan Obat Indonesia, 4, 10-13, 1992.

Kheir,Y.M.,and Patel,M.B., Isolation of Usnic Acid from Sundanese Drug Usnea moliiuscula, Planta Medica, 27,171-172,1975.

Kardono,.B.S.,Zaw,.K,and Sugiarso,Sugeng., Chemical constituents of Usnea spp from Tawangmangu.1996.

Cansaran,Demet.,dkk. Identification and Quantitation of Usnic Acid from the Lischen Usnea Species of Anatolia and Antimicrobial Activity. Ankara University,Management of Scientific Research Projects.2006.

Ø  Web :

-       http://ewiewiismail.blogspot.com/2012_05_01_archive.html

-       http://paramita-kromatografi.blogspot.com/2012/10/kromatografi-lapis-tipis-densitometri.html

-       http://www.scribd.com/doc/94180435/asam-usnat

-       http://en.wikipedia.org/wiki/Usnic_acid

-       http://en.wikipedia.org/wiki/Usnea